|
课题的研究意义
抗体是位于动物血液和组织液中起免疫作用的一类蛋白。抗体与抗原具有的高亲和性和选择性使其已广泛应用于生物学研究和临床治疗领域。特别是随着基因技术和克隆技术的发展逐渐成熟，单克隆抗体已成为治疗炎症、肿瘤和传染类疾病的有效药物。目前，已有大约20种单克隆抗体药物被FDA批准上市，至少300个还在研发中，2006年单克隆抗体类药物的产值达到了206亿美元。抗体在医疗领域的日益重要性亟需高效、稳定和低廉的生产工艺。由于抗体表达的复杂性以及对医用抗体的高质量要求，抗体纯化已成为是整个生产过程的关键步骤。
抗体是由B 淋巴细胞在对抗原的免疫应答中产生的一类糖蛋白，它能与相应的抗原特异性结合并产生各种免疫反应。这些具有抗体活性及在化学结构上相似的一类蛋白被统一命名为免疫球蛋白（Ig）。根据其重链恒定区的差异，Ig可分为五大类：μ、γ、α、δ和ξ，相应的免疫球蛋白分子，分别称为IgM、IgG、IgA、IgD和 IgE。其中 IgG是血清中主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。同类Ig的氨基酸序列及二硫键的位置和数目存在差异，据此可分为亚类。Ig有四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG的生物学活性取决于其分子中不同功能区的特性，主要表现在与抗原特异性结合，激活补体，结合细胞等几个方面。
1.2 研究现状和存在的问题
抗体纯化常用的方法是采用盐析，离子交换色谱，疏水作用色谱，凝胶过滤色谱和亲和色谱等分离手段进行多步纯化。其中亲和色谱法因其能对目标分子进行高效特异性纯化已成为抗体纯化后期最常用的色谱方法。亲和色谱是利用目标分子能与亲和配基特异且可逆结合的特性，从复杂的生物样品中分离纯化目标分子，具有选择性强，纯化效率高的优点。亲和色谱法的纯化效果取决于目标分子与配基的亲和性。因此，针对特定的目标分子，开发合适的亲和配基是构建一个亲和色谱体系所首要解决的问题。
蛋白 A(SpA) 、蛋白 G和蛋白L 已广泛用于制备高纯度的抗体。这类配基的优点在于特异性高。而缺陷在于过高的亲和力通常需要较苛刻的洗脱条件，易导致目标蛋白变性和配基脱落，吸附容量较低，此外这类配基的制备也比较困难，价格昂贵，蛋白经固定化后一般会失去部分活性。这些弱点使得蛋白类配基的应用受到限制。
亲和肽配基的研究始于1986年Geysen对合成肽库的研究，他提出：含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定簇；而且在多数情况下，几个关键残基与对应目标分子间的非共价作用构成了复合物结合的主要作用力。这两个观点奠定了亲和肽配基的理论基础。肽配基通常仅由很少的氨基酸组成，不会在产品使用时引起免疫中毒反应。而且其分子量小，即使从固定相上脱落而掺入产品中也很容易从终产物中除去。此外肽配基与蛋白质的作用条件温和，这有利于控制分离条件，避免目标蛋白的变性。和蛋白类等具有高亲和力的配基相比，亲和肽配基也具有足够高的亲和力结合目标蛋白。肽配基的构象和理化性质更稳定，能承受分离操作中较强的酸碱洗脱和再生条件，可实现在GMP条件下大规模无菌生产
研究进展：1.由本实验组之前研究得到的SpA简化模型为模板，根据重要残基之间的距离，在这些残基之间随机插入20种氨基酸，构建一个由六肽和七肽组成的分子库。该模型包含 SpA 的六个热点残基。这六个热点残基都位于两个螺旋的同一侧，因此其Cα原子都位于一个平面上，这有利于设计线性短肽而无需考虑 SpA 的高级结构。这六个热点残基在中性条件下都促进 SpA 结合 IgG。而在低pH条件下主要由H137、R146和K154驱动复合物的解离。由于K154距离其他热点残基较远，为控制多肽的长度，在构建多肽时不予考虑。首先设定F-Y 或 Y-F 的二肽结构，以模拟 SpA 中有重要疏水作用贡献的F132-Y133 二肽。其余的三个热点残基，根据空间距离分布，按照一个氨基酸的延伸长度约4~5 Å的原则，在热点残基中间插入1~2个其他氨基酸 （为了便于后期多肽合成，不包含半胱氨酸）与 N 端二肽相连。最后得到十种多肽的构建模式。除了pattern 7是纯粹模拟螺旋I对结合的影响外，其余每个多肽中都含有 4 个 SpA的热点残基，且含有1~2个影响解离的热点残基。最终构建的多肽库含有 49000条多肽。
全部的分子模拟都使用分子模拟软件 CHARMM、GROMACS 和 SYBYL 6.92(Tripos公司)完成。所有的计算都在联想工作站和曙光服务器上完成。
多肽库的构建：多肽的初始构象是使用 CHARMM 软件结合 CHARMM27力场绘制。然后采用能量最小化方法优化初始构象。最小化采用 Steepest Descent 和 adopted basis Newton-Raphson 算法，最大优化次数分别为 500 次，能量收敛为 0.05 kcal/(mol•Å)，其余均采用默认值。
受体腔的准备：通过搜索 PDB数据库获得人免疫球蛋白G1 的 Fc 片段与蛋白 A（SpA）的 B结构域的复合物晶体结构（PDB ID：1OQX，分辨率为 2.60 Å）。受体腔设定为距离SpA 6.5 Å 范围内的 Fc 片段的残基。
2.以SpA简化模型为药效团模型，首先对多肽分子进行柔性构象搜索，之后筛选多肽库；使用Unity、CATALYST软件进行基于药效团模型的数据库搜索，包括3个基本步骤：初筛。约束条件如分子的脂水分配系数、分子大小等，预先除去根本不可能的分子结构；二维子结构匹配：确定测试分子中的药效模式间的连接方式是否和提问结构相同，子结构匹配有三种方法，划分-松弛法、筛分法、回溯算法；三维结构搜索：验证数据库中的构象和药效团中的药效特征元素是否满足空间的限制条件，如果满足，则该分子是一个命中结构。结构比对：可以得到两个结构之间的每个原子坐标的叠加以及原子相应的RMSD，当RMSD小于某一值时，提问结构才满足药效团映射。因为该数据库中的分子是柔性分子时，它其他的构象可能会满足几何约束条件。需要进行柔性构象搜索。对两两药效团之间的可旋转键进行适当旋转，变量是可旋转的二面角。通过对目标函数的优化使P值达到最小。在基于药效团的数据库搜索中，对于分子的柔性可采用3种方法处理。A，为数据库中的每个分子都储存多个构象，CATALYST就提供来产生多构象数据库的工具。B，采用柔性的提问方式。C，对数据库中的每个分子进行构象分析，目前最常用的柔性构象搜索方法，常用方法包括系统搜索、距离几何、蒙特卡洛以及遗传算法、定向扭角法（搜索速度快，如Sybyl的Unity）。
3.利用2得到的多肽分子与IgG的Fc受体腔进行柔性分子对接，复筛多肽配基；初次对接使用SYBYL软件中的 FlexX2 模块，FlexX2 是一种快速的半柔性对接程序，它采用片段生长算法，充分考虑了配体的柔性，而将受体腔作刚性处理。对接时软件自动添加 Formal charge 电荷，每个多肽的最大对接次数设为300次，利用drugscore打分函数来评价多肽和Fc片段的亲和力大小，其余参数均采用 FlexX2 的默认值；
使用 Vina 软件对 FlexX2 的筛选结果做二次筛选。Vina 软件是 Autodock 对接软件的衍生版本，采用局部构象搜索的方法预测分子的结合构象，打分函数采用Autodock4的经验的结合自由能函数。对接时分子添加Gasteiger电荷，IgG的结合口袋与FlexX2对接相同。对每个多肽计算20个构象，挑选构象合理且打分最高的结果作为此多肽的对接值。其余参数均采用 Vina 的默认值。
4．粗粒化分子动力学复筛多肽；使用 MARTINI 力场和 GROMACS 软件进行粗粒化分子动力学模拟对 Vina对接筛选的多肽做第三次筛选。多肽结合 IgG 的 FC 片段的初始构象为 Vina 对接的最佳构象，采用ELNEDYN弹性网络稳定Fc片段的高级结构。每个多肽重复模拟 3 条时长 300 ns 的轨迹。分析轨迹使用GROMACS 软件包的自带分析命令，以及 CHARMM 软件和自己转换的CHARMM力场形式的MARTINI 2.0力场进行分析。分析结果取3条轨迹的平均值。
5. 亲和色谱实验验证理性设计得到的多肽
实验步骤包括多肽亲和介质的合成，RPLC检测多肽固定化效果，多肽亲和色谱实验又包含如下部分：对IgG和BSA的混合溶液进行分离，对血清中的抗体进行分离，以及和各种商业化的肽配基的性能进行比较。
可以从已下几个方面对实验操作进行优化：
1).spacer类型及长度
2).support类型
3).ligand固定化方式
4).流动性流速
5).洗脱、平衡、再生buffer种类、PH范围及离子强度
6).平衡、洗脱时间
7).原料液的浓度及上样量
8).色谱操作的温度 |