开题：陆源输入碳青霉烯类抗生素抗性基因在近岸海域的迁移转化研究
本次开题报告分为五个部分：研究现状、研究意义、研究目的、技术路线和研究方案。
研究现状：碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，并被认为是抵抗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线。但随着其广泛地使用，对细菌产生选择性压力，致使耐碳青霉烯类抗生素的细菌出现，该类细菌能合成水解碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺酶。根据Ambler分类法，碳青霉烯酶可分为A 类、B类和D类。自从1985年在英国爱丁堡皇家医院患者身上分离出的不动杆菌上检测到碳青霉烯抗性并在之后的研究中确定为携带blaOXA-23基因，之后的几年间Naas、Poirel 等人相继在医院分离的细菌中检测出blaSME、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaKPC、blaOXA-48、blaNDM等碳青霉烯类抗性基因。在2007年，Hadeer Lazim 等人在突尼斯土壤中发现了耐碳青霉烯的 Streptomyces sp. CN229 ，但未能鉴定出其所含的碳青霉烯类基因。2010年，Girlich等人在Seine river检测到blaOXA-23基因，2013年天津北塘污水处理厂检测出blaNDM、blaKPC-2、blaGES和blaVIM基因并首次对其进行定量。同年，研究者首次关注海洋环境中细菌的碳青霉烯类抗生素耐药性，对在Northern Ireland 周围采集的海水中的细菌对各种抗生素耐药性进行调查，发现有超过40%的细菌具有美罗培南抗性。近岸海域碳青霉烯类耐药基因的检出意味该类耐药基因存在大范围扩散的风险，也对人类健康与生态环境造成更大的威胁。但目前该类基因在近岸海域的数据还十分匮乏，中国还没有相关研究报道。
研究意义：利于进一步认识抗生素抗性基因在环境中的转移规律，重新评估抗生素抗性基因在环境中的传播风险。本实验拟考察碳青霉烯类抗性基因在入海过程中的含量变化，明确其在该过程中的迁移转化规律。筛选碳青霉烯类阳性菌，对其基因序列进行考察，分析与抗性基因表达调控的相关因素，并评估其潜在的健康风险。通过接合转移实验探究碳青霉烯类抗性基因在近岸海域地区传播的可能性。
研究目的：
1）对近岸海域碳青霉烯类抗性基因进行调查，确定该基因在近岸海域的分布和丰度。在此基础上全面筛选携带碳青霉烯抗性基因的细菌，对其进行鉴定，了解其在近岸海域细菌中的分布。
2) 选取各种类型的抗生素设计药敏试验，确定筛选出的携带碳青霉烯类抗性基因的海洋细菌的多重耐药性。
3) 通过海洋细菌间的接合转移实验，初步探究碳青霉烯类抗性基因在海水细菌间的扩散机制。
技术路线：
实验方案：
采样：以北塘入海口为起点，分别距离入海口0, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000m沿海岸设置7个采样点，采集水样2L。
水样总DNA检测：取1L水经0.22μm滤膜抽滤，使用sigma水样DNA提取试剂盒按照说明书步骤提取水样DNA，之后选取碳青霉烯类基因的特异性引物进行定性检测。
碳青霉烯类抗性基因细菌的筛选：用含有亚胺培南的2216E海水培养基进行筛选，挑取长出的细菌分离纯化，提取细菌宏基因组DNA，定性检测其中含有的碳青霉烯类抗性基因。
耐药细菌的药敏试验：以K-B法测定4.1中筛选出的细菌对亚胺培南、氨苄西林、头孢菌素、美罗培南、四环素、磺胺甲恶唑、环丙沙星、红霉素、链霉素和多粘菌素B的药物敏感性。
耐药质粒遗传学分析：用omega质粒提取试剂盒对检出的具有碳青霉烯类抗性基因的耐药菌的质粒进行提取，将提取后的质粒进行全测序，分析其具有的抗性基因及与其相关的各类表达调控因子和转移元件。
抗性基因接合转移实验：筛选不含β-内酰胺类抗生素抗性的细菌作为受体菌，建立接合转移体系，并在混合48h后计算接合转移效率。 |